CCl4（四塩化炭素）誘発 肝線維症モデル：プロトコル・評価マーカー・MASHモデルとの使い分けガイド
肝線維化研究の「王道」モデルである四塩化炭素（CCl4）誘発モデルのプロトコル、週数ごとの線維化進行（F1-F3）、およびMASH食餌モデルとの使い分けを徹底解説。
はじめに：なぜCCl4モデルが「肝線維化の王道」なのか
四塩化炭素（Carbon Tetrachloride: CCl4）誘発肝障害モデルは、世界中の肝線維化・肝硬変研究で最も古く、かつ最も広く用いられている前臨床動物モデルです。 近年はNASH/MASHの病態解明に伴い、高脂肪食やGAN食といった「食餌性モデル」が脚光を浴びていますが、純粋な「線維化形成過程」そのものや、抗線維化薬（直接線維化に効く薬）をスクリーニングする用途においては、CCl4モデルが依然としてゴールドスタンダードです。
本記事では、受託試験（CRO）でも頻出するCCl4モデルについて、具体的なプロトコル、組織変化のタイムライン、およびMASHモデルとの適切な使い分けを解説します。
1. CCl4による線維化誘発のメカニズム
四塩化炭素は、そのままでは高い毒性を示しませんが、肝臓の細胞内にあるシトクロムP450（主にCYP2E1）によって代謝されることで、強力な**トリクロロメチルラジカル（CCl3•）**を生じます。
- ラジカル産生と脂質過酸化: CCl3•が細胞膜の多価不飽和脂肪酸と反応し、連鎖的な脂質過酸化を引き起こします。
- 肝細胞死（ネクローシス）: 細胞膜やオルガネラが破壊され、肝細胞（Centrilobular: 中心静脈周囲を中心に）が壊死します。
- クッパー細胞の活性化: 壊死組織から放出されるDAMPs（ダメージ関連分子パターン）がクッパー細胞（肝臓の定住マクロファージ）を活性化し、TNF-αやTGF-βなどのサイトカインを放出させます。
- 肝星細胞（HSC）の活性化: 持続的なTGF-β刺激によって、ビタミンA貯蔵細胞であるHSCが筋線維芽細胞に分化し、コラーゲン（Type I, III）を過剰産生して線維化が進行します。
2. 標準的なプロトコルと投与ルート
CCl4は通常、オリーブオイルやコーンオイルなどの媒体（ビークル）に希釈して投与します（例: 10〜25% v/v）。 マウスやラットにおける一般的な投与ルートは以下の通りです。
腹腔内注射（i.p.）
- 利点: 投与量の制御が正確で、急速かつ強い肝障害を誘発できる。
- 欠点: 腹水が溜まったり、内臓癒着を起こすリスクがあり、長期生存率（特に長期間の慢性投与時）が下がる傾向がある。
- 一般的な投与枠: 週2〜3回、0.5〜1.0 mL/kgのCCl4（ビークルで希釈した総液量として）を投与。
経口投与 / 強制経口投与（p.o.）
- 利点: 腹腔内癒着のリスクがなく、実際の経口摂取毒モデルに近い。長期（8〜12週間以上）の投与に適している。
- 欠点: 胃内容物の影響で吸収にブレが生じやすく、個体間の線維化レベルにばらつきが出やすい。
吸入投与
- 利点: 非侵襲的で、一度に多頭数を処理できる。
- 欠点: 専用のチャンバー・排気設備が必要で、投与量（吸入量）の厳密なコントロールが困難。
[!TIP] CROへの委託時：薬効評価を目的とする場合は、個体差が少なくコントロールしやすい「腹腔内注射（i.p.） 週2回投与」のモデル（通常4週間または6週間）が最も多く採用されます。
3. 線維化進行のタイムライン（マウス, 週2回 i.p. の場合）
CCl4を慢性的に投与した場合、肝臓は以下のようなタイムスケールで変化します。
- 1〜2週間（初期段階 / F1相当）: 肝細胞の壊死と著しい炎症（マクロファージ浸潤）が観察されます。ALT/ASTは急激に上昇。コラーゲンの沈着はまだ軽度で、中心静脈周囲に局所的な線維化が見られます。
- 3〜4週間（進行期 / F2相当）: 架橋性線維化（Bridging fibrosis）が形成され始めます。中心静脈同士（C-C）、あるいは中心静脈と門脈（C-P）を繋ぐように線維性の隔壁が伸びていきます。抗線維化薬の標準的な評価タイミングです（モデル作製に4週間、薬剤併用投与等）。
- 6〜8週間（重度線維化・架橋形成進行 / F3相当）: 厚い線維層が肝小葉を囲い込み、架橋性線維化が高度に進行します。完全な偽小葉（再生結節）を伴う完成された肝硬変（F4）に至るにはさらに非常に長期間の投与を要するため、主にF3相当の重度線維化モデルとして評価されます。門脈圧亢進症を伴うこともあります。
回復モデル（Resolution model）としての利用: CCl4投与を4週間で「ストップ」し、そこから数週間放置すると、線維化は自然に退縮・消退します（マクロファージによるコラーゲン分解）。この「消退期」における創薬ターゲット評価にも非常に有用です（例：M2マクロファージ機能の制御など）。
4. MASH（食餌性）モデルとの使い分け
創薬プロジェクトにおいて、CCl4モデルとMASHモデル（GAN食、CDAHFD食など）のどちらを選ぶかは非常に重要です。
| 特徴 | CCl4モデル | MASH食餌モデル（例: GAN食） |
|---|---|---|
| 病態の主なドライバー | 化学毒性による直接的な細胞死・自己免疫的炎症 | 脂肪毒性、代謝異常、インスリン抵抗性 |
| 脂肪肝（Steatosis） | ほぼ無し、または非常に軽度 | 顕著（大滴性脂肪沈着など） |
| モデル作製期間 | 4〜6週間（非常に早い） | 12〜24週間以上（遅い） |
| 線維化の度合い・均一性 | 重度（F3相当へ到達可能）、個体間のばらつきが少ない | 軽度〜中等度（F2が中心）、個体差が出やすい |
| 推奨されるターゲット | HSC活性化阻害、TGF-β経路阻害、コラーゲン分解促進 | 脂質代謝改善、抗酸化、全身の代謝改善（GLP-1等） |
結論：いつCCl4を選ぶべきか？
候補化合物が「純粋にHSC（肝星細胞）のコラーゲン産生を抑える作用」や「直接的な抗線維化能」を持つ場合、代謝経路の複雑な交絡を排除でき、短期間で明確な結果（Sirius Redによる面積定量など）が得られるCCl4モデルが第一選択です。 一方、体重減少やインスリン抵抗性の改善を介した線維化改善を狙う代謝系薬剤（例：GLP-1受容体作動薬、甲状腺ホルモン受容体βアゴニスト）の場合は、MASH食餌モデルが必須となります。
5. 主要な評価マーカー一覧
CCl4試験におけるエンドポイント評価では、以下を組み合わせます。
- 組織学的評価（一番の要）: シリウスレッド染色またはマッソントリクローム染色による線維化面積の画像定量（ImageJ等を使用）。
- 生化学的評価: 血清中のALT, AST（肝障害マーカー）。ただしCCl4投与直後は非常に高くなり、サンプリングタイミングに注意が必要です。
- 遺伝子・タンパク質発現:
Col1a1,Col3a1(コラーゲン産生)Acta2(α-SMA：筋線維芽細胞マーカー)Tgfb1(主要なプロファイブロティクサイトカイン)Timp1(基質分解酵素阻害因子)
- 生化学的定量: 肝組織中のヒドロキシプロリン定量（キットまたはHPLC）による総コラーゲン量の絶対測定。
まとめ
CCl4誘発肝障害モデルは、その再現性の高さと短期間での強力な線維化誘導能力により、抗線維化薬開発の「入口」となる重要なゲートキーパーモデルです。 評価に際しては、適切な投与期間の選定と、シリウスレッド染色＋ヒドロキシプロリン定量を組み合わせた堅牢な病理評価系を構築することが、成功の鍵となります。
参考文献
1. Scholten D, et al. The carbon tetrachloride model in mice. Lab Anim. 2015;49(S1):4-11. (PubMed)
2. Iredale JP, et al. Mechanisms of spontaneous resolution of rat liver fibrosis. J Clin Invest. 1998;102(3):538-549. (PubMed)
3. Tsuchida T, Friedman SL. Mechanisms of hepatic stellate cell activation. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2017;14(7):397-411. (PubMed)